Klinefelter症候群とTurner症候群を遺伝子発現・ゲノム解析によって比較する
Integrated functional genomic analyses of Klinefelter and Turner syndromes reveal global network effects of altered X chromosome dosage
doi 10.1073/pnas.1910003117
アメリカ
個人的感想
KSとTSを比較した論文が２つ出ていた。ようやく、といった感じだ。
X染色体の過不足で何が起きるのか、特にKSとTSでは、正反対（増加または減少）に発現しているX染色体遺伝子群があり、これらと常染色体間とのグルーバルなネットワークが疾患と深く関連していると示唆される。
論文の要約
ターナー症候群(TS 45X)は約2000人に一人、クラインフェルター症候群(KS 47XXY)は約600人に一人の割合で生まれる、珍しくない染色体数異常であるが、様々な症状の原因となる遺伝子の機構についてあまりよく分かっていない。これまでに分かっているのは、SHOX geneがTSでの低身長、KSでの高身長と関連していることくらいである。
女性では2本あるX染色体のうち１本はlncRNAであるXISTによって不活化される（XCI）が、いくつかの遺伝子はこの抑制から逃れる（エスケープgenes）。
X染色体数の違いで起こるTS,KSの表現型がこれらエスケープgenesと関連しているのではないか、と推測される。
そこで今回TS、KS、一般男女のPBMC(末梢血単核細胞)を用いて、RNAseq, genome-wide targeted-capture bisulfite及びHi-C を行って比較した。
ちなみにRNAseq (XO 13サンプル、XXY 14、XX 15、XY 12）、bisulfiteは各々４サンプル、Hi-C はそれぞれ１つ、計70サンプルがGSE126712に載っている
DEG解析の結果
◆TS(XO)とXXとの比較では、予想された通りXOではX染色体のエスケープgenesの発現がdose dependentに下がる。一方、XCI領域にある遺伝子の一部（論文ではinactive genesと呼んでいる）がコントロールより上がっていた。XCI領域にある遺伝子は、XX女性でも片方が抑えられているので、XOと同じ量になると思いがちだが、そんなに単純な仕組みではないようだ。
さらにDEG1142個中 1070個は常染色体であった。1070個中145個は、sex-biased expression が報告されている。パスウェイエンリッチメント解析の一位は免疫反応パスウェイだった。
◆XXYとXYの比較では、XOとXXに比べて、DEGは数が少なく(241個)、パスウェイ解析もbiological adhesion 等目立ったものではなかった。
XXYで高発現する遺伝子のうちX染色体上にあるのが40個、うち33個はエスケープgenesで、X染色体の余分なコピーがあるXXYでは予想通りであった。
Y染色体上の遺伝子にはDEGが認められなかった。
◆XXYとXXで比較した結果 XIST, JPXの発現量に違いが無かった。つまりクラインフェルター症候群の余分なX染色体は一般女性と同じ様に不活化されている。
◆pseudoautosomal region(PAR)はX染色体とY染色体間で相同の領域で、PAR1はXpの端、PAR2はXqの端である。PAR1にある遺伝子の多くが性染色体数に比例した発現をしていた。
◆ターナー（XO)と一般女性を比較したDEGと、クラインフェルター(XXY)と一般男性を比較したDEGでオーバーラップする９４遺伝子に注目すると、
９４遺伝子中 X染色体にあるのが３１（うち２６がエスケープgenes）、他６３は常染色体にあり、興味深いことに９４個中９３個で、正反対の発現プロファイル（XX女性に比べてXOで低下なら、XY男性に比べてXXYでは増加）であった。
（この論文の一番のツボだと思う）
◆性染色体数の違いによるX染色体上の遺伝子発現変化が、PAR1やエスケープ遺伝子以外に、XCIを受ける領域にある遺伝子や、常染色体にも大きな影響を及ぼしている。
ZFX、ZBED1遺伝子がこれらの転写ネットワークに関与しているかもしれない。
KSに対する責任遺伝子の候補として RPS4X, SEPT6, NKRF, CXOrf57, NAA10, FLNAを見つけることができた。
ゲノムワイドなDNAメチル化の検証では、遺伝子発現プロファイルとの相関はほとんど見られなかったが、KSで CXorf57 とNKRFはメチル化の変化があった。
クラインフェルター症候群の末梢血のscRNAseq
Single-Cell Sequencing Reveals the Relationship between Phenotypes and Genotypes of Klinefelter Syndrome
Cytogenet Genome Res DOI: 10.1159/000503737
中国
KSは個々人の症状の違いが大きいが、それでも共通の兆候がいくつかある。
女性の不活性X染色体の１５％は抑制から逃れて発現していると言われており、それはKSにおいても起こっていると考えられる。
これまでのバルクなRNAseqでは違いが平均化されてしまったが、scRNAseqならば個々の細胞のユニークが違いが分かるかもしれないと考え、 一人のKS男性の末梢血を比較研究した。
結果
KS患者の遺伝子発現はコントロール（男性）と同じクラスターで、コントロール（女性）とは異なる。
KSで発現に違いが大きい遺伝子(DEGs)にエンリッチしているのは免疫系の遺伝子だった。
コントロール男性と比べて、T細胞で146個、 B細胞で122個, NK細胞で158個, マクロファージで265個, 樹状細胞で199個の DEGsを 確認したが、それらの多くは常染色体であった。
これまでの他のグループのRNAseqの結果と比較して共通してみられるものに、CD99 と DDX3Xがある。
HD99のハイレベルは心機能、短いQTcインターバル、不整脈を示唆し、高いDDX3Xは、肥満、炎症、 血栓などと関連がある。
HLA-Bは免疫反応に関与しているが、これがKSではいずれの細胞でも高い発現だった。
regulator of G protein signaling 1 ( RGS1 ) がKSでは、T細胞、NK細胞、樹状細胞でトップ１の発現だった。 T細胞の RGS1 を標的にする治療などが将来考えられるかもしれない。
ビタミンD投与による骨密度改善
Role of vitamin D levels and vitamin D supplementation on bone
mineral density in Klinefelter syndrome
Osteoporos Int (2015) 26:2193–2202 DOI 10.1007/s00198-015-3136-8
イタリア。ノンモザイクのKS 127名と、 年齢がマッチした成人男性60名のホルモン濃度、25-ハイドロオキシビタミンD、PTH（副甲状腺ホルモン）、骨密度をDEXAで測定した。
さらに、KS34名には、T-gel 2 % と calcifediol を2年間補充した追跡調査も行った。
この34名のうち、12名はテストステロンのみ、8名がカルシフェジオールのみ、14名が両方を補充した。
Calcifediol 補充は、 Didrogyl (Bruno Farmaceutici), 4000 IU/週から始め, 25-hydroxyvitamin D levels が 50 nmol/lを上回るように半年ごとに調整した。
調査したKSは平均年齢31.5±8.5、コントロールは 30.9±8.4 歳である。
KSの骨量変化は早い時期から始まり、成人になると加速する。精巣で発現している遺伝子は、ビタミンDのメタボリズムに関係があるものが多く、例えばチトクロームP450ファミリーCYP2R1は精巣で高発現であるが、ビタミンD活性化の鍵となる酵素である。KSの精巣萎縮はビタミンDに何らかの影響を及ぼしていると考えられる。
ビタミンDの欠乏を50 nmol/l以下として、 KSはコントロールに比べて有意に25-hydroxyvitamin Dレベルが低下していた。
またKSは腰椎および大腿骨の骨密度が低い。インシュリン抵抗性が増加している。
一方、コントロールの成人男性でも低い25-hydroxyvitamin Dの被験者は、骨密度が低下していた。
KS患者の骨密度の改善には、テストステロン補充だけでは効果は低いが、ビタミンDをともに2年間補充すると、著しい改善がみられた。
クラインフェルター症候群患者の骨ダメージに対してホルモン補充療法の効果を検討した
Long-term effect of testosterone replacement therapy on bone in
hypogonadal men with Klinefelter Syndrome
Endocrine (2018) 61:327–335 doi.org/10.1007/s12020-018-1604-6
イタリア。 15名の、これまでTRTを受けていないKS患者と、年齢及びBMIがマッチした健常対照群26名を3年間調査した。（KS患者にはTRTを開始）
もともとKSは57名いたが、30名は既にテストステロン補充をしていた、7名は25歳未満だった、5名は内分泌系の服薬をしていたため、15名となった。
この15名の平均年齢は38.46 ± 9.07 であり、特に思春期の遅れなどを感じず、大きな怪我もなくやってきた。テストステロンは8名がウンデカン酸T（ネビド）筋注、7名が皮膚透過性Tジェルで補充を開始した。
3年間に渡り、 ホルモンの測定や以下の項目を測定した。
LS(腰椎) FN（大腿骨）TH（total hip 臀部）のBMD（骨密度）
TBS（海綿骨スコア， trabecular bone score）
HSA（大腿骨近位部の骨強度を3次元的に評価する方法 hip structure analysis）
Android gynoid脂肪質量比 (内臓脂肪と皮下脂肪のバランスの指標）体脂肪率（percentage of fat mass）内臓脂肪組織（visceral adipose tissue) などをDEXA（二重エネルギー X線吸収測定法）によって測定。
結果
LS,FN,THの骨密度はKSが有意に低い
TBSは違いが無い
HSAはKSが有意に薄くなっている
テストステロン補充を受ける期間に比例して、LSのみ骨密度が少し改善した
体脂肪はKSが有意に高く、テストステロン補充の効果はあまり認められなかった
TBSとHSAに関してはテストステロン補充の効果は認められなかった
KSと健常者ともに、脂肪率は、TBSに逆相関していた。
今のところ、骨の三次元構造の強さと、脂肪組織の逆相関は、脂肪細胞と骨細胞の直接の関係なのか、単なる見た目上の逆相関なのか、分からない。
以前から報告されていたように、テストステロンは骨密度の低下を部分的にしか補えない。
KSに認められる骨密度の低下、骨の構造的なもろさなど、性ホルモン以外の他の因子が関与している可能性が大きい。
前糖尿病段階の患者群に8年にわたってテストステロン療法を施した報告
Testosterone Therapy in Men With Hypogonadism Prevents Progression From Prediabetes to Type 2 Diabetes: Eight-Year Data From a Registry Study
Diabetes Care 2019 Mar 12.
doi: 10.2337/dc18-2388
前糖尿病段階と２型糖尿病（T2D)の患者は、しばしば低いテストステロン値を示す事が知られている。そこで、低テストステロン症状への介入によって、2型糖尿病への進行が抑えられるのかどうか調べた。
316人の前糖尿症状(HbA1c 5.7-6.4%)かつトータルテストステロンレベルが 12.1nmol/L 以下を対象とした。
229人は非経口testosterone undecanoate補充、87人は補充なしで、8年間、身体、代謝計測を続けた。
その結果、ウンデカン酸テストステロンを補充されたTグループの HbA1c は 0.39 ± 0.03% (P < 0.0001) 減少した一方、補充を受けなかったグループは、0.63 ± 0.1% (P < 0.0001)増加した。
また、Tグループの 90% は HbA1c <5.7% （正常域）になったが、未補充のグループは 40.2% が２型糖尿病への進行した(HbA1c >6.5%)。
テストステロン補充療法により、糖・脂質代謝も目覚ましい改善が見られた。
triglyceride:HDL 比, triglyceride-glucose インデックス, lipid accumulation product 脂質の蓄積, total cholesterol 総コレステロール, LDL, HDL, non-HDL, triglycerides, and Aging Males' Symptoms (AMS) scale.
未補充のグループでは、上記の値は悪化をたどり、死亡率も、Tグループが 7.4% に対して、未補充グループは 16.1% であった(P < 0.05)。また、死には至らなかったが、心筋梗塞が起こったものが、Tグループでは 0.4% に対して、未補充グループは 5.7% であった(P < 0.005).
論文のイントロに書いてあるが、アメリカ糖尿病協会は2018年に「糖尿病に対するメディカルケアの標準」として、テストステロン値の測定を推奨している。
テストステロンがどのように糖代謝をコントロールしているか、そのメカニズムは、おそらくインシュリン感受性を上げていると考えられる。 24週（約半年）のテストステロン補充療法によって、インシュリン感受性が上がり、体脂肪・体重が減少したとの報告がある。
そして細胞レベルでは、テストステロン補充療法は、グルコースキャリアGLUT4, インシュリンレセプター、インシュリンレセプターサブストレート１の増加を誘導し、インシュリンを介したグルコーストランスポートの能力を強めている。
lncRNA GAS5がクラインフェルター症候群では上がっている
Evidence for long noncoding RNA GAS5 up-regulationin patients with Klinefelter syndrome
https://doi.org/10.1186/s12881-018-0744-0
イタリア、末梢血からのRNAseq
2倍以上の上昇１７５０、2分の１以下の減少 2698遺伝子
GAS5は1番染色体にあるノンコーディングRNAで、KSでは5.171-fold (q-value<0.0001) 上昇していた。
ｑPCRで確認、KS内でのばらつきがある。
リューマチやSLE,multiple sclerosis, sarcoidosis, osteoarthritis and inflammatory bowel diseaseで GAS５のレベルが変化していることが報告されている。GAS5は炎症や自己免疫疾患に関与している。atherogenesis、動脈硬化のプラークには多く発現している。
lncRNAであるGAS５はIGF1R をダウンレギュレートする事が知られているが、KSではIGF1Rがダウンしている。
Insulin and IGF1 receptors are essential for XX and XY gonadal differentiation(2013) という報告がある事から、GAS5によるIGF1RのダウンレギュレートはKSの生殖細胞ロスを説明できるかもしれない。
Klinefelter syndromeに特有のmiRNA発現パターン
Decreased miRNA expression in Klinefelter syndrome
https://doi.org/10.1038/s41598-017-16892-3
KSの末梢血を使って、マイクロRNA分析を行った。
60 down- and 13 up-regulated で、特にMIR3648と MIR3687が下がっている。ｑPCRでも確認した。
MIR3648は減少だが、MIR3687はKSでは発現していない。この２つのmicroRNAはいずれも２１番染色体にある。
metformin が前脂肪細胞の分化を抑えることが示されているが、２週間5MMのmetforminトリートにより、内臓由来の脂肪前駆細胞では 27種のmiRNAがアップし、6種のmiRNAがダウンする。
その中で特に miR-1246 と miR-3687 がアップしている。
つまり、脂肪細胞への分化が抑制されている状態ではmiR-3687は上がっているが、KSではこれが全く発現していないという事になる。 この発見は脂肪細胞の分化がmiRNAによって調節されていることを示唆し、miR-1246, miR-3687, miR-422aを ターゲットとした内臓肥満の治療の可能性を示している。
mir-3687のターゲット遺伝子は、いくつか分かっており、PPARGC1B(PPARG coactivator 1β), MEMO1 (mediator of cell motility 1) 、 GDF7である。
PPARGC1Bは、いくつかの転写因子を活性化し、脂肪の酸化、グルコース代謝、エネルギー支出に関与しているのかもしれない。前糖尿病、2型糖尿病代謝ではこのタンパク質が低下しているし、この遺伝子のヴァリアントは肥満リスクを増す。
MEMO1は、銅依存性のレドックスタンパクで、insulin-like growth factor-I receptor-dependent signalling eventsの調節を介して、乳がんに関与している。
GDF7は分泌型のリガンドで、TGFベータスーパーファミリーに属している。この遺伝子を欠損したマウスは、 ドーパミン型ニューロンが形成されず、脳の形成不全、雄の不妊、未熟な時期での死が報告されている。
もしこれが本当で、臨床でMIR3687を投与するような事が可能になれば、、と思ってぐぐってみると、2017年のCellにこのような論文が出ている。
Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity
Cell. 2017 Oct 5; doi: 10.1016/j.cell.2017.08.035.
http://aasj.jp/news/watch/7496 西川先生が日本語で解説したページにリンクを張ることにする。
